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文献解读 | TP63调控超级增强子驱动的长非编LINC01503在鳞状细胞癌中过表达和起致癌作用

2018-08-28

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TP63调控超级增强子驱动的长非编LINC01503在鳞状细胞癌中过表达和起致癌作用

Super-Enhancer-Driven Long Non-Coding RNA LINC01503, Regulated by TP63, Is Over-Expressed and Oncogenic in Squamous Cell Carcinoma.

影响因子:20.773

背景和目的:LncRNA的表达具有组织特异性,但尚不清楚它们是如何调节的。 作者的目标是寻找鳞状细胞癌(SCC)特异性lncRNAs并研究调控它们表达和功能的机制。


方法:作者采用RT-QPCR、过表达和干扰LINC01503的表达、Chip-Seq、荧光素酶报告分析、单克隆形成、迁移、侵袭、质谱分析、裸鼠成瘤、FISH、RNA pulldown和RIP等技术研究鳞状细胞癌特异性LINC01503的表达模式和功能。


结论:1、LINC01503是由一个超级增强子SE调控的lncRNA,并且在食管鳞癌和头颈鳞癌中的表达显著高于癌旁;2、鳞状细胞癌里LINC01503的高水平表达与病人的短生存期相关;3、转录因子TP63结?#31995;絃INC01503的SE位点上并激活其转录;4、ESCC细胞里LINC01503过表达会增强细胞的增殖、单克隆形成、迁移和侵袭,干扰LINC01503的表达会抑制细胞的增殖、单克隆形成、迁移、侵袭和裸鼠的肿瘤生长;5、ESCC细胞中LINC01503降低DUSP6对ERK2的去磷酸化导致其通过MAPK激活ERK信号通路。LINC01503破坏EBP-1与PI3K亚基p85的结合激活AKT信号通路。


结果详解

1

鉴定食管鳞状细胞癌中超强增强子相关的致癌LncRNAs

作者首先采用H3K27ac ChIP-Seq 挑选了4个候选的与超强增强子相关的致癌LncRNAs,它们分别是FAM83H-AS, MIR205HG, PVT1和 LINC01503(Supplementary Figures 1-3)。利用TCGA数据库的芯片数据分析发现相比正常组织,4个LncRNAs都在头颈鳞癌和肺鳞癌中表达上调(Figure 1C, Supplementary Figure 4),这说明了它们具有SCC表达特异性。接着利用siRNA干扰每个LncRNA的表达后进行MTS检测细胞增?#24120;?#26368;终挑选有符?#26174;?#26399;功能变化且差异显著的LINC01503作为后续研究食管鳞癌细胞的唯一对象(Supplementary Figure 5, Figures 4A-B)。

作者进一步通过多个在线数据库预测LINC01503的编码潜能和保守性,结果显示LINC01503的编码潜能?#20808;?#19988;无保守性。而且,RNA pull-down实验显示LINC01503与核糖体蛋白LP0无相互作用(Supplementary Figure 6)。这些数据均证实LINC01503是一个非编码蛋白。


2

LINC01503在SCC肿瘤中特异性表达上调

作者通过RNA-Seq和qRT-PCR分析证实LINC01503在ESCC细胞中高表达(Supplementary Figure 7)。来自CCLE数据库的cDNA微阵列数据显示LINC01503在SCC细胞里高表达,包括头颈鳞癌和食管鳞癌 (Figure 1A)。部分表?#27542;鯯CC基因组和表观基因组特征的膀胱癌也呈现高表达。这些均表明LINC01503具有SCC特异性调节。作者的在不同肿瘤细胞系里qRT-PCR结果也印证了CCLE的结果(Figure 1B)。值得注意的是, LINC01503在食管腺癌细胞中几乎无表达,证实了其SCC特异性调控。另外两个GEO公开的数据也证实 LINC01503在ESCC样本中表达高于邻近的非恶性食管黏膜组织(Figure 1D-E)。作者利用qRT-PCR分析发现LINC01503在113对ESCC组织中的表达显著高于相匹配的癌旁组织 (Supplementary table 3, Figure 1F)。更重要的是,LINC01503高表达与短生存期和无病生存期显著相关( Figure 1G-H),表明其具有重要的生物学意义。


3

LINC01503是一个SCC特异性超级增强子驱动的基因

为了解LINC01503的转录调控特征,作者在5个ESCC和3个EAC细胞系里进行了H3K27ac ChIP-Seq分析,结果发现在其中3个ESCC细胞株 (TE7, TE5, and TT) LINC01503上游存在超级增强子但在3个EAC细胞里均无,而且在基因邻近区存在大量的超强增强子和普通增强子也呈现ESCC特异性表达模式 (Figure 2A, lower panel)。作者进一步利用环状染色质构象捕获技术分析研究TE7细胞LINC01503-SE区域的相互左右模式。将两个增强子作为观察点研究SE与LINC01503转录起始位点及其母基因的互作关系(Figure 2A, upper panel, B, and C)。结果发现在LINC01503基因区存在较强的增强子活性和转录调控 (Figure 2A, upperpanel, Supplementary Figure 8)。

作者猜测是SCC特异性转录因子赋予了LINC01503-SE SCC特异性,于是采用SCC细胞里2个最主要的转录调控因子进行Chip-seq,发现TP63 Chip-seq表达谱在基因组上?#34892;?#22810;突出的峰,其中最高的峰与LINC01503-SE有重叠(Figure 2A and B),这提示TP63参与转录调控LINC01503。紧接着,作者将LINC01503-SE分段克隆到增强子报告基因载体并用荧光素酶报告基因实验检测它们的活性(Figure 2B),结果发现E2和E3增强子区在4株ESCC细胞都能检测到被激活,E1增强子区只能在TE7和TE5细胞里被激活(Figure 2A、2D、2E,Supplementary Figure 9A and B),但3个增强子在EAC细胞里均不能被激活(Supplementary Figure 9C and D),再次强调了其具有SCC特异性超级增强子的特性。


4

TP63通过结合LINC01503-SE激活它的转录

因为TP63的结合位点位于增强子E2区,作者将E2全长和分段(E2A和E2B)克隆到荧光素酶报告基因载体上并进行荧光素酶报告基因检测,结果发现在干扰TP63表达的ESCC细胞里,E2和E2A的活性降低,E2B的活性不变 (Figure 3A )。接着进行Chip-qPCR证实TP63与SCC细胞里E2A区特异性结合(Figure 3B ),且干扰TP63后下调了LINC01503的表达(Figure 3C )。另外,在ESCC、HNSC细胞系和ESCC组织里TP63和LINC01503的表达呈强正相关(Figure 3D、3E )。在干扰TP63的ESCC细胞里过表达SCC特异性亚型?Np63逆转干扰后引起的LINC01503的下调(Figure 3F)。


5

LINC01503促进食管鳞癌细胞的恶性表型

在ESCC细胞里干扰LINC01503的表达抑制细胞的增殖、单克隆形成、迁移和侵袭,过表达LINC01503则促进细胞的增殖、单克隆形成、迁移和侵袭(Figure 4)。


6

LINC01503与EBP-1和ERK2相互作用

FSH和qRT-PCR检测证实LINC01503主要位于胞浆,少量位于胞核(Figure 5A、5B)。用生物素标记的LINC01503进行RNA-pull down后将蛋白产物跑胶银染和质谱检测(Figure 5C、5D)。在质谱检测排名前10的蛋?#23383;校珽BP-1是PI3K-AKT信号通路的主要调控因子,ERK2是ERK/MAPK信号通路的重要成分,所以作者挑选了EBP-1和ERK2作为候选研究对象。作者用LINC01503探针进行RNA-pull down和CHIRP实验后用WB检测均可测到EBP-1和ERK2的表达(Figure 5E、5F)。最后作者用EBP-1和ERK2进行Chip-qPCR均可检测到LINC01503的表达(Figure 5G)。


7

LINC01503通过结合EBP-1和ERK2激活PI3K/AKT和ERK/MAPK信号通路

作者进一步探索LINC01503在激活PI3K/AKT和ERK/MAPK信号通路方面的潜在作用。通过WB检测发现敲低LINC01503能显著降低EGF诱导的ERK1/2、Akt、p70S6K和mTOR磷酸化水平,但EGFR和MEK1/2的磷酸化水平?#27425;?#21457;生变化(Figure 6A)。

ERK1/2是由MEK1/2磷酸化和由包括DUSP-6在内的磷酸化酶去磷酸化的。作者猜测LINC01503与ERK2间的相互作用能减弱ERK1/2的去磷酸化,因为LINC01503的敲低并未引起MEK1/2活性的改变。为了验证这一猜想,作者采用了CO-IP检测了DUSP-6与ERK2相互作用,发现无论有没有EGF处理,LINC01503敲低后两者的相互作用均加强,,说明LINC01503与ERK2结合会抑制DUSP-6和ERK2的相互作用从而抑制ERK2的去磷酸化(Figure 6B)。作者进一步干扰DUSP-6发现ERK1/2的磷酸化水平增加了,过表达DUSP-6强烈的抑制了ERK1/2的磷酸化水平,证实了DUSP-6介导ESCC细胞系ERK2的去磷酸化作用(Figure 6C、6D)。

EBP-1直接与PI3K的p85亚基结合,导致它通过泛素化蛋白酶体途径降解。作者发现,干扰LINC01503后,EBP-1和p85的结合能力增强。作者进一步用可以提升p85稳定水平的MG132处理细胞,发现缺乏LINC01503会增加EBP-1和p85的结合,但是MG132处理能恢复LINC01503干扰引起的p85的下降(Figure 6E)。作者还证实了干扰ESCC细胞里EBP-1的表达能增加PI3K p85和p-AKT的表达水平,过表达EBP-1会抑制该通路(Figure 6F、6G)。这些数据均表明LINC01503阻止EBP-1与p85的结合,抑制PI3K泛素化,最终导致PI3K-AKT信号通路的激活。


8

LINC01503的靶向治疗潜能

作者下一步建立了稳定干扰LINC01503表达的ESCC细胞株并进行软琼脂克隆形成实验和裸鼠成瘤实验。结果与MTT的检测结果一致,干扰LINC01503后细胞的增殖下降(Figure 7A、7 B),而且裸鼠成瘤的体积和重量均减少(Figure 7C、7 D)。WB检测发现干扰LINC01503的肿瘤样本PI3K/AKT和ERK/MAPK信号通路也下调(Figure 7E、7 F)。

为测试LINC01503的靶向治疗潜能,作者用MTT实验评估LINC01503敲低后对AKT抑制剂MK2206和MEK抑制剂U0126的抑制效率的影响。结果显示MK2205对TE7细胞的IC50约为6.068μM ,对KYSE510细胞的IC50约为7.027μM,干扰LINC01503表达的细胞IC50数值下降了10倍以上。在ERK抑制剂U0126的作用下,同样可见干扰LINC01503表达的细胞IC50数值下降了(Figure 7G)。



文章亮点:

1、?#19994;攪司?#26377;SCC特异性的且由超级增强子调控的lncRNA;

2、运用了多种研究分子互作的技术,如Chip-Seq、RNA pulldown、RIP和环状染色质构象捕获技术等,使文章整体上了一个档次;

3、充分利用各大数据库芯片检测结果,与作者的结果互相印证,是结果更具说服力;

4、逻辑严谨,每一步?#35780;?#37117;是有理有据,论证充分。

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